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Actividad antiviral de cloroquina contra el coronavirus humano OC43 La infección en ratones recién nacidos RESUMEN Hasta hace poco, los coronavirus humanos (HCoVs), tales como la cepa HCoV OC43 (HCoV-OC43), se conoce principalmente a causa del 15 al 30 de infecciones de las vías respiratorias superiores leves. En los últimos años, la identificación de nuevos HCoVs, incluyendo grave coronavirus del síndrome respiratorio agudo, reveló que HCoVs pueden ser altamente patogénico y pueden causar infecciones de las vías más graves superior e inferior respiratorias, incluyendo la bronquiolitis y la neumonía. Hasta la fecha, no hay medicamentos antivirales específicos para prevenir o tratar infecciones HCoV están disponibles. Se demuestra que la cloroquina, un fármaco ampliamente utilizado con efectos antipalúdicos conocidos, inhibe la replicación HCoV-OC43 en las células HRT-18, con una concentración de 50 efectivos (desviación estándar) de 0,306 0,0091 M y una concentración de 50 citotóxica (desviación estándar) de 419 192,5 M, resultando en un índice de selectividad de 1369. Además, se investigó si la cloroquina podría prevenir la muerte HCoV-OC43-inducida en ratones recién nacidos. Nuestros resultados muestran que una infección letal HCoV-OC43 en ratones C57BL / 6 recién nacido puede ser tratada con cloroquina adquirido transplacentaria o través de la leche materna. Se encontró que la tasa de supervivencia más alta (98,6) de los cachorros cuando los ratones madre se trataron diariamente con una concentración de 15 mg de cloroquina por kg de peso corporal. Las tasas de supervivencia se redujo de una manera dependiente de la dosis, con 88 la supervivencia cuando se trataron con 5 mg / kg de cloroquina y 13 la supervivencia cuando se trataron con 1 mg / kg de cloroquina. Nuestros resultados muestran que la cloroquina puede ser muy eficaz contra la infección HCoV-OC43 en ratones recién nacidos y puede ser considerado como un medicamento contra el futuro HCoVs. Los coronavirus son grandes, envuelto, de cadena sencilla, de sentido positivo de virus de ARN con un genoma de aproximadamente 30 kb de longitud, la más grande que se encuentra en cualquiera de los virus de ARN. El género Coronavirus pertenece a la familia Coronaviridae en el orden Nidovirales. Los coronavirus se clasifican en tres grupos en función de las relaciones genéticas y serológicas. Grupo 1 contiene porcina virus de la diarrea epidémica, virus de la gastroenteritis porcina transmisible, coronavirus canino, virus de la peritonitis infecciosa felina, coronavirus humano 229E (HCoV-229E), y HCoV-NL63. Grupo 2 contiene virus de la hepatitis murina, coronavirus bovino (BCoV), HCoV-OC43, virus de la rata sialodacryoadenitis, hemaglutinante porcina Encefalomielitis por virus (PHEV), coronavirus respiratorio canino, equino y coronavirus. Las severas coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) se considera un miembro distante del grupo 2 y por lo tanto se coloca en un subgrupo, 2b (13). Grupo 3 contiene hasta el momento sólo coronavirus aviar, como el virus de la bronquitis infecciosa y coronavirus de pavo. En el grupo 2, HCoV-OC43 está más estrechamente relacionado con BCoV genética (33). Un análisis comparativo de los genomas completos de HCoV-OC43, BCoV, y PHEV demostró una alta similitud genética entre estos tres coronavirus en más de dos tercios de sus genomas, excepto en la región hemaglutinina-esterasa y el gen de pico, en el que PHEV se notablemente divergentes de HCoV-OC43 y BCoV (30. 31. 33). HCoVs causan infecciones respiratorias, pero también pueden ocurrir trastornos gastroenteritis y neurológicos (3. 20). Hasta ahora, se han descrito cinco HCoVs. HCoV-OC43 y HCoV-229E son responsables del 10 al 30 de todos los resfriados comunes, y las infecciones se producen principalmente durante el invierno y principios de primavera (21). En 2003, una novela HCoV mostrando sólo similitudes antigénicas y genéticas distantes a los dos HCoVs conocidos anteriormente fue identificado como el agente causal del SARS, y esto hace que el trastorno pulmonar grave, conduciendo en algunos casos a la infección sistémica y, finalmente, la muerte en el 10 de los casos (19). Durante los dos años después de la epidemia de SARS, dos coronavirus previamente no reconocidos adicionales que afectan a los seres humanos, HCoV-NL63 y HCoV-HKU1, se identificaron (29. 35). infección HCoV-NL63 se relaciona con la disfunción respiratoria aguda en individuos infectados. Además, HCoV-NL63 fue identificado como el principal patógeno responsable de crup en niños pequeños (9. 10. 22). Las características clínicas de las infecciones HCoV-NL63 parecen ser más graves que los que comúnmente se atribuye a las infecciones por HCoV-OC43 y HCoV-229E (4. 12. 29). La infección con HCoV-HKU1 se asocia sobre todo con la bronquiolitis y la neumonía (35. 36). A pesar de los coronavirus han sido reconocidos como patógenos humanos de unos 50 años, ninguna estrategia de tratamiento eficaz ha sido aprobado. Esta deficiencia se hizo evidente durante el brote de SARS-CoV y fue el inicio de numerosos estudios. Sin embargo, 5 años después del estallido, faltan aún un fármaco eficaz disponible en el mercado. La cloroquina es un fármaco clínicamente aprobado eficaz contra la malaria, y se sabe para provocar efectos antivirales contra varios virus, incluyendo el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (23. 26. 28), virus de la hepatitis B (18), y virus herpes simplex tipo 1 ( 27). Savarino y sus colegas plantearon la hipótesis de que la cloroquina podría ser de alguna utilidad para el manejo clínico de SRAS (25). Por otra parte, se informó que la cloroquina para inhibir la replicación del HCoV-229E (7) y el SARS-CoV (16) in vitro. En un estudio anterior, hemos demostrado que el 50 concentración efectiva (CE 50) de la cloroquina (8,8 1,2 M) para la inhibición de la infección por SARS-CoV in vitro fue significativamente inferior a su actividad citostática (261,3 14,5 M), obteniéndose un índice de selectividad de 30, y que esta CE 50 se aproxima a las concentraciones plasmáticas de cloroquina alcanzado durante el tratamiento de la malaria aguda. La adición de cloroquina a los cultivos infectados podría retrasarse hasta por 5 horas después de la infección sin una caída significativa en la actividad antiviral (16). Los efectos antivirales de la cloroquina contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 en la replicación actualmente se están probando en ensayos clínicos (25). La cloroquina es una base débil que aumenta el pH de las vesículas ácidas. Cuando se añade extracelularmente, la porción de la cloroquina nonprotonated entra en la célula, donde se convierte en protonado y se concentró en ácidos, orgánulos de bajo pH, tales como los endosomas, vesículas de Golgi y lisosomas. La cloroquina puede afectar a la infección por virus de muchas maneras, y el efecto antiviral depende en parte de la medida en la que el virus utiliza para la entrada de los endosomas. Además de tener un efecto antiviral directo, la cloroquina está dotado de una actividad inmunomoduladora, la supresión de la producción y liberación de factor de necrosis tumoral alfa y la interleuquina 6, que median las complicaciones inflamatorias de varias enfermedades virales (25). En el presente estudio, se investigó además las propiedades anticoronaviral de cloroquina ensayando la actividad antiviral in vitro de la cloroquina contra HCoV-OC43. Además, hemos desarrollado un modelo de desafío letal in vivo para probar el efecto antiviral de la cloroquina contra HCoV-OC43. Materiales y métodos Virus y células. La cepa OC43 fue originalmente obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). células HRT-18 (ATCC, Rockville, MD) se propagaron en medio esencial mínimo (MEM Gibco, Life Technologies, Rockville, MD) suplementado con suero fetal de ternera 10 (Integro, Zaandam, Países Bajos), 1 l - glutamine (Gibco) y 1,4 bicarbonato de sodio (Gibco). virus de las células infectadas se mantuvieron en MEM suplementado con suero de ternera fetal 2. Para mediciones de la actividad y citotoxicidad antivirales, sobrenadante se recogió después de 4 días de incubación a 37ºC en presencia de 5 CO 2. Real-time RT-PCR. La metodología del ensayo de PCR en tiempo real de la transcriptasa inversa (RT-PCR) se ha descrito previamente (32). En pocas palabras, la RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) se realizó con una mezcla de reacción de 25 l con 5 l extrajo ARN, 12,5 l de Eurogentec de un solo paso QRT-PCR mezcla maestra que contiene ROX como un tinte de referencia pasiva, 0.125 l EUROSCRIPT transcriptasa inversa / inhibidor de RNasa (Eurogentec, Seraing, Bélgica), 300 nM adelante y atrás primers, y 200 nM MGB (unión al surco menor de 3) de la sonda. La amplificación y detección se realizaron en un ABI Prism 7700 Sequence sistema de detección (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para permitir la cuantificación absoluta HCoV-OC43, las normas de cRNA se construyeron y se utilizaron para la generación de una curva estándar como se describe anteriormente (32). QRT-PCR basada en el ensayo de actividad antiviral. mediciones antivirales se basaron en la reducción en el título viral de las células de coronavirus infectados. células HRT-18 se sembraron a una densidad de 6 10 4 células por pocillo en una placa de cultivo de 24 pocillos. Después de 4 días de crecimiento, las células se infectaron con 1 10 6 copias HCoV-OC43 por ml en presencia de diversas concentraciones de cloroquina que van desde 0,032 hasta 500 M. Después de 4 días de incubación a 37ºC en presencia de 5 CO 2. se recogieron los sobrenadantes celulares. El ARN vírico se extrajo utilizando el kit de ARN viral QIAamp (Qiagen, Venlo, Países Bajos) para determinar la carga de ARN viral en el sobrenadante de las células mediante el uso de la qRT-PCR descrita anteriormente. Ensayo de citotoxicidad. mediciones de citotoxicidad se basaron en la viabilidad de las células HRT-18 en presencia de diversas concentraciones de los compuestos de ensayo. Cuatro días después de la adición de los compuestos, las células viables se cuantificaron por un método colorimétrico basado en tetrazolio en el que la reducción de la MTS de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxi-fenil) 2- (4-sulfofenil) -2 H - tetrazolium colorante (CellTiter 96 acuoso un kit Solución Promega, Países Bajos) por deshidrogenasas mitocondriales a un formazano coloreado soluble se midió con un espectrofotómetro (Multiskan EX, Thermo Labsystems, Bélgica) en 492 Nuevo Méjico. La concentración citotóxica 50 (CC 50) se definió como la concentración del compuesto que redujo la viabilidad celular por 50. ensayo de tiempo-de-adición. monocapas subconfluentes de células HRT-18 en placas de 24 pocillos se infectaron con 4 7 10 HCoV-OC43 genoma equivalentes por ml de MEM. Después de 30 min de adsorción, las monocapas celulares se lavaron cinco veces con MEM. La cloroquina se añadió por triplicado a una concentración 30 veces más alta que la CE 50 en el momento de la infección o en diferentes puntos de tiempo a partir de entonces. Veinte y ocho horas después de la infección, se recogió el sobrenadante celular. El ARN vírico se extrajo utilizando el kit de ARN viral QIAamp (Qiagen) para determinar la carga de ARN viral en el sobrenadante de las células mediante el uso de la qRT-PCR descrita anteriormente. estudios de infección del ratón. Seis semanas de edad, de sexo masculino y femenino ratones C57BL / 6 (Elevage Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Francia) se acoplaron. ratones hembra embarazada no se trataron o se inyectaron por vía subcutánea con 200 l de diferentes diluciones de la cloroquina (correspondiente a 1, 5 o 15 mg / kg de peso corporal) al día a partir de 2 días antes del parto. Posteriormente, cinco días de edad, C57BL / 6 cachorros fueron inoculados por vía intracerebral con 10 l de dilución de virus (es decir, 1 10 3 HCoV-OC43 copias virales / 10 l) utilizando una jeringa 30G Micro-Fine estéril (BD Consumer Healthcare, Franklin Lakes, NUEVA JERSEY). Los ratones lactantes se controlaron diariamente para la mortalidad. Los ratones supervivientes fueron seguidos durante 60 días después de la infección. En los experimentos de conmutación, se utilizaron tres grupos de ratones C57BL / 6 embarazadas. Un grupo de ratones se trataron una vez con 15 mg / kg de cloroquina 1 día preparto, un grupo de ratones fueron tratados diariamente con 15 mg / kg después del parto, y un grupo no recibió ningún tratamiento con cloroquina y sirvió como el control de la infección. En el día de nacimiento, se cambiaron la camada de grupo 1 y el grupo 2 de la camada. Con el tiempo, los recién nacidos en el grupo 1 recibieron cloroquina sólo a través de la leche materna y los recién nacidos en el grupo 2 recibieron cloroquina única vía transplacentaria. Después de 5 días, los 5 días de edad ratones lactantes fueron inoculados por vía intracerebral con 1 10 3 copias del genoma de HCoV-OC43. Todos los ratones fueron tratados de acuerdo a las directrices de control de animales de laboratorio de nuestro instituto, que se ajusten a las de la Comisión Europea. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en un centro de nivel de bioseguridad 2. Análisis estadístico. Todas las pruebas estadísticas se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 4.00. El nivel de significación se fijó en un valor de p de 0,05. RESULTADOS En la actividad antiviral in vitro de la cloroquina. QRT-PCR representa una herramienta útil en la determinación de la actividad antiviral de un compuesto contra HCoV-OC43. En este ensayo antiviral, el efecto inhibidor del compuesto sobre la replicación viral se calcula por cuantificación del crecimiento viral (es decir, equivalentes de RNA del genoma) en presencia del compuesto en comparación con el crecimiento viral sin el compuesto (es decir, el control positivo). La CE 50 del compuesto se define como la concentración que inhibe el aumento de ARN viral por 50. Para permitir absoluta RNA cuantificación HCoV-OC43, las normas de cRNA se construyeron y se utilizaron para la generación de una curva estándar. Una concentración más alta que la cloroquina 0,16 M da como resultado una disminución en el número de copias HCoV-OC43 (datos no mostrados). La CE 50 (desviación estándar) de la cloroquina se calculó en 0,306 0,091 M. La CC 50 (desviación estándar) fue 419,0 192,5 M. La cloroquina inhibe la replicación in vitro de HCoV-OC43 con un índice de selectividad de 1369. El índice de selectividad se determinó como la relación de la CC 50 a la CE 50. La actividad antiviral de la cloroquina administrada en diferentes puntos temporales después de la infección coronavirus. Un ensayo de tiempo de adición se lleva a cabo para determinar la actividad antiviral in vitro de la cloroquina cuando se añade en diversos puntos temporales después de la infección de virus. Para este propósito, HRT-18 células fueron infectadas con HCoV-OC43. La cloroquina se añadió a una concentración de 10 M (es decir, 32,7 veces el CE 50) a diferentes puntos de tiempo después de la infección. Los niveles de ARN viral en los sobrenadantes celulares se determinaron 28 horas después de la infección. La medición de la carga viral muestra que se requiere la cloroquina en el momento de la infección para bloquear la replicación HCoV-OC43 (Fig. 1). Cuando se añadió cloroquina en el momento de la infección, el ARN viral se pudo detectar todavía, pero la carga viral se redujo 100 veces en comparación con la carga viral de control positivo. En los puntos de tiempo posteriores, se observó una pérdida de la actividad antiviral de la cloroquina. Dependiente del tiempo efecto antiviral de la cloroquina sobre la replicación HCoV-OC43 en HRT-18 células. HRT-18 infectada por el HCoV-OC43 células se trataron con 10 M cloroquina en el momento de la infección o en diferentes puntos de tiempo a partir de entonces (). El control de virus representa las células infectadas por el HCoV-OC43 incubaron con medio (). El fondo () representa la carga viral residual que se detectó después de lavar las células. Veinte y ocho horas después de la infección, se recogieron los sobrenadantes de células y el ARN viral se extrajo y se cuantificaron mediante qRT-PCR. Los datos son valores medios errores estándar de las medias de dos experimentos independientes realizados por duplicado. La actividad antiviral de la cloroquina contra una infección letal HCoV-OC43 en ratones C57BL / 6 recién nacidos. Investigamos si la cloroquina podría evitar la muerte en ratones recién nacidos como resultado de la infección con HCoV-OC43. C57BL / 6 ratones fueron seleccionados teniendo en cuenta su susceptibilidad a HCoV-OC43 (14. 15). Los ratones preñados se dejaron sin tratar o tratados por vía subcutánea 1 día preparto o 1 día después del parto con cloroquina (1, 5, o 15 mg / kg). Posteriormente, ratones lactantes de 5 días de edad fueron inoculados por vía intracerebral con 1 10 3 copias del genoma de HCoV-OC43. Este procedimiento nos permitió distinguir entre la cloroquina transmitida a través de la placenta, así como la leche materna y la cloroquina transmite únicamente a través de la leche materna. En camadas de madres no tratadas, todos los cachorros murieron dentro de los 6 días después de HCoV-OC43 desafío (Fig. 2). Una tasa de supervivencia 100 se observó en las camadas de los ratones madre que fueron tratados con 15 mg / kg preparto cloroquina (Tabla 1 y Fig. 2A) (97,4 supervivencia de las camadas de las madres postparto tratada). Las tasas de supervivencia de las crías se redujeron de una manera dependiente de la dosis, con 88,1 supervivencia (92,9 preparto cuando los ratones madre fueron tratados y 83,3 supervivencia cuando fueron tratados después del parto) cuando se trataron con 5 mg / cloroquina kg y 13,5 supervivencia (33,3 cuando los ratones madre eran preparto tratada y 0 cuando fueron tratados después del parto) cuando se trata con 1 mg / kg de cloroquina. Un test de rangos logarítmicos indicaba que la curva de supervivencia para las camadas que fueron tratados preparto con 15 mg de cloroquina / kg fue significativamente diferente de las curvas de supervivencia de los cachorros que fueron tratados preparto con 5 mg / kg (P 0,0237), 1 mg / kg ( P 0,0001). Las curvas de supervivencia de los ratones recién nacidos después de la infección HCoV-OC43. Los ratones recién nacidos fueron infectados por vía intracerebral con 10 3 copias HCoV-OC43, y los ratones madre fueron tratados por vía subcutánea con 1, 5, o 15 mg / kg de cloroquina (CQ) preparto (A) o después del parto (B). N representa el número de ratones por grupo madre, y n representa el número de ratones recién nacidos por grupo. número absoluto de animales que sobrevivieron 60 días después de la transferencia HCoV-OC43 desafío cloroquina a través de la placenta y la leche materna. través Dado que la tasa de supervivencia fue mayor en los ratones recién nacidos de madres tratadas preparto, se investigó el papel de los transplacentaria y por vía oral (a través de la leche materna) adquirió la cloroquina. En este estudio, se dio una dosis de 15 mg de cloroquina / kg a los ratones madre, porque esta dosis resultó en casi 100 supervivencia de las crías. Para la configuración de esta prueba, los ratones embarazadas fueron divididas en tres grupos. Sólo los ratones madre del grupo 1 se trataron con cloroquina 1 día preparto. En el día de nacimiento, las crías de madres tratadas (grupo 1) se cambiaron a los ratones no tratados madre (grupo 2) y viceversa. Con el tiempo, los recién nacidos en el grupo 1 recibieron cloroquina sólo a través de la leche materna, y los recién nacidos en el grupo 2 recibieron cloroquina única vía transplacentaria. Posteriormente, ratones lactantes de 5 días de edad fueron inoculados por vía intracerebral con 1 10 3 copias del genoma de HCoV-OC43. En camadas de madres no tratados (grupo 3), todos los cachorros murieron dentro de los 6 días después de HCoV-OC43 desafío (Fig. 3). La tasa de supervivencia de los ratones recién nacidos que recibieron la cloroquina solamente transplacentaria (grupo 2) fue de 0 (0/27) (Tabla 1). La tasa de supervivencia de los ratones recién nacidos que recibió la cloroquina través de la leche materna (grupo 1) era 69,0 (20/29). Un test de rangos logarítmicos indicaba que no había una diferencia significativa entre la curva de supervivencia para los cachorros que recibieron cloroquina transplacentaria y la curva de supervivencia para los cachorros que recibieron la cloroquina sólo a través de la leche materna (P 0,0001). Las curvas de supervivencia de los ratones recién nacidos después de la infección HCoV-OC43. ratones lactantes de cinco días de edad, se infectaron por vía intracerebral con 10 copias HCoV 3-OC43 y hicieron o no reciben la cloroquina (CQ), ya sea a través de la placenta o de la leche materna a través. N representa el número de ratones por grupo madre, y n representa el número de ratones recién nacidos por grupo. DISCUSIÓN Como HCoVs ya no se consideran tan inofensivo como se suponía anteriormente y ya que pueden estar asociados con infecciones de las vías respiratorias graves, la identificación de compuestos eficaces contra estos virus es un tema importante. La cloroquina es un fármaco clínicamente aprobado eficaz contra la malaria, y se sabe para provocar efectos antivirales contra varios virus, incluyendo SARS-CoV y HCoV-229E (7. 16. 17). Sin embargo, los estudios in vivo fueron incapaces de demostrar la eficacia antiviral de la cloroquina contra (6) SARS-CoV. En el presente estudio, hemos investigado las propiedades anticoronaviral de cloroquina ensayando sus in vitro e in vivo en actividades antivirales contra el virus del grupo 2 HCoV-OC43. En los experimentos antiviral in vitro, la cloroquina mostró propiedades antivirales in vitro contra la replicación HCoV-OC43 en las células HRT-18, con un EC 50 de 0,306 M. El 50 CC 50 era 419 M, resultando en un índice de selectividad de 1369. En comparación con la actividad anti-SARS-CoV de cloroquina, con un EC 50 de 8.8 M y un índice de selectividad de 30 (16), la inhibición de la replicación HCoV-OC43 por cloroquina es más potente. El mecanismo exacto de la intervención antiviral por cloroquina aún no se aclara pero es posiblemente un mecanismo multidiana, dependiendo del punto de tiempo en el que se añade el fármaco. Cuando se añade durante y poco después de la infección, la cloroquina probablemente afecta la fusión endosoma mediada, y cuando el medicamento se administra después de este primer objetivo, todavía puede actuar en las últimas etapas del ciclo de vida viral, como se informó para otros virus (25). Para la actividad anti-SARS-CoV, la cloroquina se comprobó igualmente activa cuando se añade durante la adsorción del virus o 1 h después de la infección. Más tarde, se observó una pérdida gradual de la actividad antiviral (16). Vicente y colegas encontraron que la cloroquina es eficaz en la prevención de la infección por SARS-CoV en cultivo celular. Cuando el fármaco se añade 24 h antes de la infección a una concentración de 10 M, la infectividad se eliminó por completo. Por otra parte, encontraron que la cloroquina fue significativamente eficaz incluso cuando se añadió el medicamento 3 a 5 h después de la infección, lo que sugiere un efecto antiviral incluso después del establecimiento de la infección. Dado que estos investigadores obtuvieron resultados similares por NH 4 Cl tratamiento de células Vero, los mecanismos subyacentes de la acción de la cloroquina y NH 4 Cl podrían ser similares y podría ser atribuido a las propiedades alcalinas de ambos compuestos (34). Curiosamente, nuestros experimentos de tiempo de adición con HCoV-OC43 señalaron que se requería la cloroquina en el momento de la infección para bloquear la replicación HCoV-OC43. Cuando se añade en el momento de la infección, la cloroquina reduce la carga viral por 2 logaritmos en comparación con el valor de control positivo. En los puntos de tiempo posteriores, se observó una pérdida de actividad antiviral de la cloroquina. Por lo tanto, la cloroquina parece actuar sólo en la entrada de HCoV-OC43 y no en las etapas posteriores del ciclo de replicación. Debido a este espectro notablemente amplio espectro de acción contra los coronavirus, hemos desarrollado un modelo in vivo para probar las propiedades antivirales de la cloroquina contra HCoV-OC43. Nuestros resultados muestran que una infección letal HCoV-OC43 en ratones C57BL / 6 recién nacido puede ser tratado con una concentración antiviral eficaz de cloroquina adquirido transplacentaria o través de la leche materna. Los ratones preñados fueron tratados una vez con varias dosis de cloroquina preparto o después del parto. Dado que la tasa de supervivencia fue mayor en los ratones recién nacidos cuando la madre fue tratada preparto (Fig. 2A), que investigó el papel de (la leche materna es decir, a través de) por vía transplacentaria y por vía oral adquirió la cloroquina en un segundo experimento. En camadas de madres no tratadas, todos los cachorros murieron dentro de los 6 días después de la exposición HCoV-OC43. Todos los ratones recién nacidos que recibieron la cloroquina exclusivamente transplacentaria murieron (Fig. 3). Una posible razón para la mortalidad 100 puede ser que la cloroquina no se transfiere a través de la placenta. Esto es muy poco probable, ya que casi todos los xenobióticos que se dan durante el embarazo pueden entrar en la circulación de la sangre fetal a través de difusión pasiva. Por otra parte, la distribución transplacentaria de la cloroquina en los seres humanos y conejos ya se ha documentado (1. 2. 11). En las ovejas, por otro lado, la velocidad de transferencia de la cloroquina de la madre al feto fue baja (5). están disponibles para la transferencia transplacentaria en ratones pero no los datos, aunque la transferencia placentaria de la cloroquina en ratones parece probable, dada la tasa de supervivencia de los ratones recién nacidos tratados, tanto antes como después del nacimiento es más alta que la tasa de supervivencia de los ratones recién nacidos tratados únicamente después del nacimiento. El 100 la mortalidad de los cachorros que recibieron cloroquina única vía transplacentaria es más probable atribuible a una concentración baja de forma ineficaz de la cloroquina alcanzado en los ratones recién nacidos. La cloroquina se acumula en los tejidos y órganos de la madre y el feto, y poco después de la administración, se alcanza un equilibrio entre la madre y el feto (2. 24). La concentración de cloroquina alcanzado después de equilibrio en el feto, en el caso de tratamiento con 15 mg / kg preparto cloroquina, no es posiblemente suficiente para proteger contra una infección letal HCoV-OC43. Una dosis más alta de la cloroquina en este modelo animal no es una opción, ya que los experimentos anteriores con 30 mg / kg de cloroquina preparto o posparto administrado revelaron que esta dosis era tóxico para los ratones madre y letal para los cachorros (datos no mostrados). En los seres humanos, la cloroquina se acumula en las glándulas de la leche, lo que resulta en concentraciones altas de cloroquina en la leche materna (1. 8). La concentración de cloroquina en la sangre de los ratones lactantes aumenta con la cantidad de leche materna que beben. De esta manera, una concentración eficaz cloroquina antiviral puede ser alcanzado. La tasa de supervivencia de los ratones recién nacidos que fueron cambiados después del nacimiento y recibieron cloroquina sólo a través de la leche materna (las madres fueron tratados con 15 mg de cloroquina / kg) fue 69,0 (20/29). Esta tasa es inferior a la tasa de supervivencia de los ratones recién nacidos cuyas madres recibieron posparto cloroquina (97,4). Una razón para esta menor tasa de supervivencia en las camadas de conmutación se puede atribuir al hecho de que los ratones madre, tratados preparto con cloroquina en el segundo experimento, recibieron la cloroquina 2 días antes que los ratones madre desde el primer experimento que fueron tratados después del parto. De esta manera, la cloroquina ya se distribuyó a sus crías biológicas. Por lo tanto, parte de la cloroquina ya se metaboliza y excreta, lo que lleva a reducir las concentraciones de cloroquina en las camadas conmutadas. Además, el estrés para los ratones madre, causada por el interruptor de los cachorros y posiblemente resultando en pobres de enfermería de los cachorros, también puede explicar la mayor tasa de mortalidad de los cachorros conmutadas. En un estudio in vivo por Barnard y sus colegas, los ratones BALB / c se infectaron con el SARS-CoV y tratados con cloroquina (6). En ese estudio, no se observó una reducción significativa en la replicación del SARS-CoV in vitro e in vivo, y esto fue en contraste con los hallazgos de otros publicados en estudios in vitro (16. 34) y nuestro estudio in vivo. Esta diferencia de resultados es posiblemente debido a una diferencia en el modelo animal, un modelo de infección (no letal) en ratones BALB / c frente a un modelo letal en ratones C57BL / 6 recién nacidos, y un esquema de tratamiento antiviral diferente. Por otra parte, el efecto antiviral in vitro de la cloroquina contra el SARS-CoV es menos potente que el efecto antiviral contra HCoV-OC43 in vitro. Para el SARS-CoV, las concentraciones plasmáticas alcanzadas en los ratones no son posiblemente lo suficientemente alto como para proteger contra una infección por SARS-CoV. En conclusión, hemos demostrado aquí que la cloroquina muestra una fuerte in vitro e in vivo contra las actividades antivirales HCoV-OC43. Por otra parte, el tratamiento con dosis diarias de cloroquina tiene un efecto protector de larga duración contra el coronavirus OC43 letal infección en ratones recién nacidos. Agradecimientos Este trabajo forma parte de las actividades del SARS-DTV Red Euro-asiática (SP22-CT-2.004-511064) apoyados por el programa de desarrollo tecnológico Comisión Europea específico de investigación y Integración y fortalecimiento del Espacio Europeo de Investigación. Este trabajo fue apoyado por una beca postdoctoral del Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) - Vlaanderen a Piet Maes. NOTAS Recibido el 12 de noviembre de 2008. devueltos para Modificación 24 de diciembre de 2008. Aceptado 9 de abril de 2009. Autor para la correspondencia. Dirección postal: Laboratorio de Virología Clínica, Departamento de Microbiología e Inmunología, Instituto Rega para Investigación Médica, Universidad de Lovaina, Minderbroedersstraat 10, B3000 Lovaina, Bélgica. Teléfono: 32-16-347908. Fax: 32-16-347900. E-mail: marc. vanranst uz. kuleuven. be publicado antes de impresión el 8 de junio de 2009. Las referencias Akintonwa, A. S. A. Gbajumo, F. y A. Mabadeje. 1988. placenta y la leche transferencia de cloroquina en los seres humanos. Ther. Monit drogas. 10: 147 -149. Akintonwa, A. M. C. Meyer, y M. K. Yau. 1983. La transferencia placentaria de la cloroquina en conejas preñadas. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 40: 443 -455. Arbour, N. R. Day, J. Newcombe, J. y P. Talbot. 2000. neuroinvasión por coronavirus respiratorios humanos. J. Virol. 74: 8913 -8921. Arden, E. K. M. D. Nissen, T. P. Sloots, e I. M. Mackay. 2005. 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